SACLA는 방사선 손상없이 정확한 결정 크레이지 슬롯 머신를 결정하는 데 성공했습니다. -World Crystal Year 2014, Laser X -ray가 개설 한 다음 세기의 이정표

2014 년 5 월 12 일

Riken Research Institute, 독립 행정 기관
Hyogo Precepctural University Public University Corporation
높은 브리트 니스 가벼운 과학 연구 센터, 공익 단체 설립 재단
Osaka University 크레이지 슬롯 머신
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이 연구 결과의 요점
○ X- 선 조사의 영향없이 단백질의 정확한 3 차원 크레이지 슬롯 머신를 결정합니다
○ 단백질 작업의 모든 순간의 정확한 그리기를 향한 꾸준한 첫 단계
○ 생명 과학과 재료 과학 사이의 새로운 다리 개발
1. 뒤로보기
1910 년대 영국에서 독일에서 Laue 박사와 Bragg 박사의 X- 선 회절이 발견 된 이후 (각각은 노벨상 상을 수상한) X- 레이는 다양한 결정의 원자 배열 (결정 크레이지 슬롯 머신)을 공개했습니다. 생명 과학 분야에서, DNA의 이중 나선 크레이지 슬롯 머신의 결정을 포함하여 수많은 단백질의 3 차원 크레이지 슬롯 머신가 명확 해졌다. 이 크레이지 슬롯 머신 정보는 작용하는 단백질의 메커니즘을 이해하는 데 중요하며 생물학적 기능을 설명하고 약물 발견에 대한 연구에 유용합니다. 특히, Synchrotron Light[4]라는 밝은 X- 선 광원의 출현으로 연구가 급격히 진행되었으며, 이미 구조적으로 분석 된 거의 100,000 개의 단백질의 약 80%는 싱크로트론 방사선을 사용한 X- 선 결정 구조 분석에 의해 결정되었습니다. 최근 대형 싱크로트론 방사선 시설 "Spring-8[5]"의 밝은 싱크로트론 방사선을 사용하여 광합성을 담당하는 단백질 중 하나에 포함 된 촉매의 구조가 처음으로 명확 해졌습니다.
그러나, 싱크로트론 방사선을 소스로 사용한 X- 선 결정 구조 분석에서, "방사선 손상"은 오랜 문제였습니다. 많은 물을 함유하는 단백질 결정에서, 물은 X- 선 조사 후 피코 초 (1 피코 초 1 초)에서 고도로 반응성 분자로 변합니다. 반응성 분자와의 이러한 화학 반응은 단백질의 구조를 변화시킨다. 그중에서도 단백질 기능을 담당하는 활성 사이트[6]5304_5454
한편, 2011 년 6 월 7 일에 성공적으로 진동하는 Sacla의 레이저 X- 레이는 Spring-8보다 10 억 배나 더 밝고 초음파 X- 선 조사, 피코 초의 1/10 번째 1 차를 사용하여 크레이지 슬롯 머신 분석에 필요한 X- 선 회절 사진을 촬영할 수있어 방사선 손상을 유발할 수 있습니다. 이는 데이터가 방사선 손상보다 빠르게 측정 될 수 있음을 의미합니다.
결정 크레이지 슬롯 머신 분석의 대상 인 시토크롬 산화 효소의 활성 부위는 X- 선에 매우 민감하며, 방사선 손상, 작지만 불필요하게 불필요하게 크레이지 슬롯 머신적 변화로 인해 오랫동안 작동하는 방법을 이해할 수없는 단백질 (효소) 중 하나입니다. 시토크롬 옥시 다제는 생명의 근본적인 기능을 전달하는 막 단백질이며, 산소 호흡을 통한 생물학적 활성을위한 에너지 물질 인 아데노신 트리 포스페이트 (ATP)의 생산의 핵심이다 (도 1A). 시토크롬 산화 효소는 공기에서 물로 산소를 감소시켜 ATP 생산으로 이어지는 에너지를 추출합니다. 따라서 산소에서 어떤 분자가 변경되었는지, 활성 부위에 어떻게 결합하는지 아는 것은 시토크롬 산화 효소의 기능을 이해하는 데 필요한 기본 정보입니다. 생화학 적 및 분광 실험 결과는 과산화물 음이온이 효소 반응 전에 시토크롬 산화 효소의 활성 부위에 결합된다는 것을 시사한다. 그러나, 싱크로트론 X- 선 결정 크레이지 슬롯 머신 분석은 분석 결과 (도 1B)와 비슷한 과산화 음이온에 대해 일반적으로 불가능하지 않은 산소 원자 사이의 거리를 보여 주었고, 활성 부위의 정확한 상태를 알 수 없었다.
공동 연구 그룹은 시토크롬 산화 효소에 대한 검증을 수행하고 펨토초 X- 선 레이저 결정 크레이지 슬롯 머신 분석이 방사선 손상에 의해 영향을받지 않고 X- 선에 매우 민감한 단백질에 대해서도 높은 정확도를 갖는 단백질의 정확한 크레이지 슬롯 머신를 결정할 수 있음을 증명하기 위해 노력했다.

2. 연구 방법 및 결과
펨토초 X- 선 레이저 결정 크레이지 슬롯 머신 분석의 경우, Sacla 레이저 X- 선과 큰 결정의 조합이 필수적입니다. 위에서 언급했듯이, 매우 짧은 시간에 대량의 X- 레이를 결정으로 보낼 수있는 Sacla의 레이저 X- 레이를 사용하면 방사선 손상을 유발하는 고도로 반응성 분자보다 크레이지 슬롯 머신 분석을 위해 더 빠른 데이터를 수집 할 수 있습니다. 이것은 방사선이없는 X- 선 결정학 분석의 요구 사항입니다. 또한, X- 선으로 더 많은 단백질과 상호 작용하는 SACLA 레이저 X- 선으로 큰 결정을 조사함으로써, 고정 크레이지 슬롯 머신 크레이지 슬롯 머신 결정에 필수적인 명확한 X- 선 회절 사진을 찍을 수 있습니다.
SACLA의 레이저 X- 레이를 사용하여 펨토초 X- 선 레이저 결정 크레이지 슬롯 머신 분석을 실현하기 위해, 공동 연구 그룹은 미크론 정확도로 1 μm의 얇은 얇은 크기를 결정의 표적 부위에 조사 할 수있는 회절 실험 장치를 만들었습니다 (그림 2A). X- 선 결정 크레이지 슬롯 머신 분석은 다양한 방향으로부터 결정에 X- 레이를 적용해야하며, 3 차원 X- 선 회절 사진 세트가 촬영된다. 그러나 방사선 손상은 X- 선이 한 번 X- 선에 노출 된 사이트에서 발생하므로 방사선 손상을 포함하지 않는 크레이지 슬롯 머신적 분석에서는 결정의 움직임을 정확하게 제어하고 SACLA 레이저 X- 선으로 새로운 부위를 조사하여 항상 X- 레이 회절 사진을 찍는 것이 필수적입니다 (그림 2 B).
펨토초 X- 선 레이저 결정 크레이지 슬롯 머신 분석에 의해 수집 된 방사선이없는 데이터의 전자 밀도는 과산화물 음이온이 취할 수있는 1.55Å (angstroms)의 원 자간 거리를 나타냈다 (도 3A). 이 결과는 펨토초 X- 선 레이저 결정 크레이지 슬롯 머신 분석을 사용하여 방사선 손상없이 X- 선 결정 크레이지 슬롯 머신 분석을 수행 할 수 있음을 증명합니다.
다음으로, 우리는 과산화물 음이온의 광분해에 의해 생성 된 물 분자 (도 3 b의 적색 화살표)가 활성 부위에서 아미노산 잔기 티로신 244 (도 3B의 전자 밀도)에서 캡처된다는 현상에 초점을 두었다. 활성 부위에서 아미노산 잔류 물 티로신 244에서 포획 된 물 분자의 전자 밀도는 엑스 선 X- 선 레이저 결정 크레이지 슬롯 머신 분석에 의해 0.38이었으며, X- 선에 의해 물 분자를 생성하지 않는 시안화물 이온에 결합 된 시토크롬 옥시 다제의 결과와 비교할 수있다 (도 3 C). 이 결과는 레이저 X- 선의 초시-쇼트 10 펨토초 조사 동안 과산화물 음이온의 광분해가 발생하지 않았으며, 펨토초 X- 선 레이저 결정 크레이지 슬롯 머신 분석이 방사선 손상없이 수행 될 수 있음을 증명한다는 명확한 지표이다.
두 가지 관점에서, 펨토초 X- 선 레이저 결정 크레이지 슬롯 머신 분석은 방사선 손상없이 X- 선 결정 크레이지 슬롯 머신 분석을 허용하고, 시토크롬 산화 효소의 활성 부위의 정확한 크레이지 슬롯 머신에 대한 자세한 조사는 상이한 풍부 비율을 갖는 퍼 옥사이드 이온이 두 금속 이온 모두에 결합하는 크레이지 슬롯 머신를 나타냈다 (도 3D). 이 크레이지 슬롯 머신는 활성 부위의 이전에 알려진 자기 특성과 일치하며, 상기 언급 된 생화학 적 분광 실험 결과와 일치한다. 따라서,이 크레이지 슬롯 머신는 X- 선 조사의 영향을받지 않는 정확한 활성 부위 크레이지 슬롯 머신라고 결론 지을 수있다.
"Femtosecond x-ray 레이저 결정 구조 분석"Sacla의 X- 선 레이저를 사용하여 달성 된 새로운 결정 구조 분석 방법은 X- 선으로 조사하기 전에 정확한 구조를 분석하는 수단, X- 선에 매우 민감한 단백질을 제공합니다. 약물 발견과 같은 "제조"의 설계에 고효율 및 정확도로 기능하는 우수한 분자 기계 인 단백질의 정확한 구조를 통합 할 가능성이 예상된다.

3. 미래의 기대
공동 연구 그룹이 개발 한 펨토초 X- 선 레이저 결정 구조 분석 방법은 단백질의 근무 수명의 모든 순간을 정확하게 묘사하는 "고정밀 고속 시간 분할 구조 분석 방법"을 개발하는 기초입니다. 단백질 기능의 높은 정확도와 효율성은 단백질의 정확한 "움직임"에 의존합니다. 예를 들어, 실온의 온화한 환경에서 화학 반응을 수행하는 효소 단백질의 기능은 기판을 생성물로 전환하는 과정에서 순간 전이 상태로 보이는 전이 상태입니다.[7]의 크레이지 슬롯 머신에 보완 된 크레이지 슬롯 머신에 강하게 결합함으로써 달성된다. SACLA의 고강도 초고속 폴스 X- 선 레이저가 가능하게하는 펨토초 노출 시간을 사용하는 고정밀, 고속 시간 분할 크레이지 슬롯 머신 분석 방법이 완성되면, 인공 촉매 설계뿐만 아니라 단백질의 크레이지 슬롯 머신뿐만 아니라 단백질의 크레이지 슬롯 머신를위한 최종 목표뿐만 아니라 단백질의 크레이지 슬롯 머신를 정확하게 볼 수있을 것입니다. 일하다. 이를 통해 단백질의 작동 방식을 처음으로 배울 수 있습니다. SACLA를 사용하여 지금까지 도달하지 않은 단백질의 기능에 대한 동적 정보를 추출하는 첫 번째 단계는 펨토초 X- 선 레이저 결정 크레이지 슬롯 머신 분석의 발달입니다.

원래 종이 정보 :
Hirata, K.*, Shinzawa-itoh, K.*, Yano, N., Takemura, S., Kato, K., Hatanaka, M., Muramoto, K., Kawahara, T., Tsukihara, T., Yamashita, E., Tono, K., Ueno, G., Hikima, T., Murakami, H. Ishikawa, T., Yamamoto, M., Ogura, T., Sugimoto, H., Shen, J-.R., Yoshikawa, S.**, Ago, H.**(*똑같이 기여한 저자,**해당 저자), "Xfel을 사용한 X- 선 민감성 단백질의 손상없는 결정 구조 결정"자연 방법, 2014, doi : 10.1038/nmeth.2962

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<발표자/연락처 정보>
(Contact)
Riken Research Institute, 독립 행정 기관
동기 과학 연구 센터
시스템 개발 연구 부서 사용
Beamline Infrastructure Research Department
생명 시스템 싱크로트론 방사선 활용 시스템 개발 장치
　　풀 타임 연구원 전 히고
　　전화 : 0791-58-2839 팩스 : 0791-58-2834
　　센터 디렉터 이시카와 테츠야
　　전화 : 0791-58-2800 팩스 : 0791-58-2898

동기 과학 연구 프로모션 사무소
　　전화 : 0791-58-0900 팩스 : 0791-58-0800

(발표자)
Riken Research Institute, 홍보 사무소 관계 사무소
　　전화 : 048-467-9272 팩스 : 048-462-4715

<추가 설명>
[1] Sacla
Riken과 High-Brightness Light Science 센터가 공동으로 건설 한 일본 X- 선 프리 렉스 론 크레이지 슬롯 머신저 시설. 정확한 제어하에 가속기에서 전자 질량을 동시에 진동하고 전자 질량으로부터 크레이지 슬롯 머신저 X- 선을 생성하는 X- 선 발생기. 이것은 2006 년부터 시작하여 5 년 계획에 걸쳐 건설 및 유지 보수에서 수행 된 국가 핵심 기술 중 하나입니다. 2011 년 3 월에 완료되었으며 Spring-8 Angstrom Compact Free-Electron 크레이지 슬롯 머신저의 이니셜이 이니셜로 선정되었습니다.

[2] 방사선 손상
X- 크레이지 슬롯 머신에서 소유 한 에너지는 X- 크레이지 슬롯 머신와 상호 작용하는 분자의 파괴를 유발합니다. 그것은 X- 선과의 직접적인 상호 작용으로 인해 분자를 분해 할뿐만 아니라 분자를 파괴하는 과정에서 발생하는 전자 또는 깨진 분자로부터 생성 된 고도로 반응성 분자가 분자가 관찰되는 것과 화학적으로 반응 할 수있는 경우도있다. 단백질 결정에서 일반적으로 알려진 방사선 손상은 X- 선 조사 후 피코 초 시간 스케일에서 물을 생성하는 고도로 반응성 분자, 단백질과의 화학적 반응 일 때 발생합니다.

[3] 고정밀 고속 시간 시간 크레이지 슬롯 머신 크레이지 슬롯 머신 분석 방법
단백질 작동 순간을 절단하고 크레이지 슬롯 머신를 분석하는 방법. SACLA의 XFEL 펄스는 10 펨토초의 광 방출 시간을 방출하기 때문에, 이론적으로 10 개의 펨토초보다 긴 수명을 가진 크레이지 슬롯 머신를 분석 할 수 있습니다. 이 분석을 실현하기 위해, 결정에서 모든 단백질의 기능을 동기화하고 동시에 활성화시키는 기술과 조합하여 실험해야한다.

[4] 동기 조명
산란 된 빛은 상대 론적 하전 입자 (전자 또는 양전자)가 자기장에 의해 구부러질 때 이동 방향으로 방출되는 전자기 파입니다. 방사선은 밝고 방향성이 뛰어나며 빛의 편광 특성을 자유롭게 변화시킬 수있는 것과 같은 우수한 특징을 가지고 있습니다. 참조:

[5] Spring-8
Riken 's 시설은 Hyogo 현 Harima Science Park시에 위치한 세계 최고의 싱크로트론 방사선을 생산합니다. Spring-8은 Super Photon Ring 8gev에서 나옵니다.
참조 :

[6] 활성 사이트
효소 반응이 발생크레이지 슬롯 머신 단백질의 특정 부위. 일반적으로, 활성 부위에서, 바이어스 전자 분포 및 전자가 풍부한 금속 이온을 갖는 아미노산의 측쇄는 효소 반응을 발전시키기 위해 작용기로서 존재한다. 이들 기능성 그룹은 비교적 반응성이 높기 때문에, X- 선 조사에 의해 물에서 생성 된 반응성 분자에 의해 공격하기 쉽고, 활성 부위는 방사선 손상이 발생하기 쉬운 부위 일 가능성이있다.

[7] 전환 상태
반응의 분자가 특히 높은 에너지 상태에있는 기판이 생성물로 변형 된 화학 반응이있는 상태를 지칭한다. 기판은 전이 상태로 들어가기 위해 다량의 에너지가 필요하기 때문에, 기판을 생성물로 변환하려면 기판이 전이 상태에 도달크레이지 슬롯 머신 에너지를 줄이기 위해 촉매를 사용해야한다.




(a) 시토크롬 산화 효소는 활성 부위 (빨간 원)로 호흡하여 물에 의해 흡수 된 공기에서 산소를 감소시킴으로써 얻은 자유 에너지에 의해 구동되는 수소 이온 수송 펌프이다. 수소 이온 농도의 이러한 차이는 생물학적 활성을위한 에너지 물질 인 생합성 아데노신 트리 포스페이트 (ATP)에 사용된다. 황색 화살표는 활성 부위에서 산소가 흡수되어 물로 전환되는 과정을 개략적으로 나타내며, 오렌지색은 산소를 물로 감소시킴으로써 얻은 에너지를 사용하여 미토콘드리아의 지질 이중층을 끼우는 수소 이온의 펌핑을 개략적으로 나타낸다. 오른쪽의 이미지는 활성 사이트의 확대 된보기입니다. SACLA는이 연구에서 관찰 된 방사선 손상의 영향없이 활성 부위에서 전자 밀도를 나타내는 데 사용됩니다. 흰색 화살표는 활성 부위를 생성크레이지 슬롯 머신 2 개의 금속 이온 (구리 : Cub 및 철 : Heme A3의 Fea3)에 결합 된 산소 변경 과산화물 음이온이다.(b) X- 선 결정 크레이지 슬롯 머신 분석에 대한 X- 선 조사는 과산화물 이온을 분해하고, 과산화물 음이온에 해당하는 전자 밀도 (파란색 타원으로 표현 된)의 길이 (개략적으로 표현됨)는 증가 하였으므로, 이전의 X- 선 결정 크레이지 슬롯 머신 분석은 X 선 부위의 정확한 크레이지 슬롯 머신를 결정할 수 없었습니다.


(a) SACLA의 크레이지 슬롯 머신저 X- 크레이지 슬롯 머신를 사용한 방사선 손상의 영향없이 단백질 결정에서 X- 선 회절 사진을 촬영하기위한 회절 실험 장치. 크레이지 슬롯 머신저 X- 크레이지 슬롯 머신는 결정의 원하는 위치로 정확하게 조사 될 수있다.(b) 펨토초 X- 선 레이저 결정 크레이지 슬롯 머신 분석에서, X- 선 회절 사진은 10 개의 펨토초 레이저 X- 선 펄스의 하나의 맥박으로 촬영된다. 이전 사진에서 발생한 방사선 손상의 영향을 피하기 위해, 결정은 각 사진에서 번역되며 X- 선 회절 사진은 항상 새로운 위치에서 촬영됩니다. 또한, 결정은 사진과 사진 사이의 일정한 각도로 회전하고 X- 선 회절 사진은 3 차원 적으로 촬영된다. 이전의 X- 선 결정 크레이지 슬롯 머신 분석은 몇 초 동안 노출 시간이 필요하며,이 긴 노출은 단백질에 대한 방사선 손상의 원인입니다.



​​(a) 및 (b)에서 빨간색 화살표에 의해 나타난 전자 밀도를 가장 잘 나타내는 과산화물 이온의 산소 흡연 거리를 조사하기 위해, 크레이지 슬롯 머신적 정제 계산은 상이한 흡수기 이온에 피팅하여 크레이지 슬롯 머신적 정제 계산이 수행되었다. 과산화물 음이온 모델 주변의 나머지 전자 밀도 (진한 파란색 바스켓 모델, 녹색 이중선으로 계산에 사용 된 퍼 옥사이드 음이온 모델의 차이로 인한 변화를 나타내는 변화를 보여주는 것은 산소 원자 사이의 거리가 1.55Å 인 경우 최소였으며, 이는 1.55 Å의 원자 성 거리가 적합하다는 것을 나타냅니다.(b) 산소 감소 부위에서 방사선 손상이없는 전자 밀도 다이어그램. 2 개의 금속 이온 (적색 구체 : 철 이온, 청색 구체 : 구리 이온)에 결합 된 과산화물 음이온의 전자 밀도는 적색 화살표로 표시됩니다. 이 과산화물에 대한 방사선 손상에 의해 생성 된 물은 근처의 티로신 잔기 (a로 표시된 전자 밀도)에 의해 포획된다. 연한 파란색 구체는 물 분자를 나타냅니다. X- 선이 적용된 경우에도 주변의 전자 밀도는 변하지 않으므로 A로 표시된 전자 밀도를 정상화크레이지 슬롯 머신 데 사용되었습니다. 황색 선은 탄소-탄소 결합을 나타냅니다. 라인은 파란색과 노란색, 빨간색 및 노란색으로 칠해진 선은 각각 질소와 탄소, 산소 및 탄소의 결합을 보여줍니다.(c) 전자 밀도의 높이 A (b)에 표시된 비교.(d) 방사선 손상의 영향없이 시토크롬 산화 효소의 활성 부위의 크레이지 슬롯 머신. 그림 1b의 왼쪽 부분은 Heme A3 (FEA3 및 주변의 질소 : N)에 해당합니다.